نام استاد : دکترمختار جلالی     

 نام ارائه دهنده:علي بوش

 رشته :بيوتكنولوژي

 تاریخچه: تاریخچه: طرح نقشه برداری و تعیین توالی کل ژنوم انسان اولین بار در سال 1984 در کنفرانسی در Alta Uta عنوان شد . تأمین قسمتی از بودجه این پروژه را دپارتمان انرژی آمریکا بعهده گرفت و در سال 1988 کنگره امریکا رسماً اجرای پروژه ژنوم انسانی را از سال 1991 به مدت 15 سال تصویب کرد. در این سال انسیتوبهداشت ملی آمریکا (NIH) نیز برای اجرای این طرح اعلام آمادگی کرد. بزودی کشورهای انگلیس ،فرانسه ، آلمان و ژاپن نیز به این پروژه پیوستند . در سال 1998 سازمان ژنوم انسانی (HUGO ) ایجاد شد . اهداف اولیه پروژه ژنوم انسانی که از سوی HUGO دنبال می شد چنین است :· تعیین نقشه دقیق ژنتیکی کروموزومها · تهیه نقشه فیزیکی کروموزومهای اورگانیسمهایی که بعنوان مدل انتخاب شده اند · تعیین توالی کل ژنوم انسان · ایجاد شبکه های ارتباطی و بانکهای اطلاعاتی

معرفي پروژه:

پروژة ژنوم انسان در سال 1990 با تخصيص بودجه­اي معادل 3 ميليارد دلار (ساليانه 200 ميليون دلار) و با همكاري مشترك دپارتمان  انرژي(DOE) و موسسة ملي بهداشت(NIH) آمريكا آغاز شد. در واقع طرح اين موضوع، از اواسط دهة 1980 ميلادي و با هدف درك مباني بروز 4000 بيماري ژنتيكي انسان عنوان گرديد و سال­هاي پاياني اين دهه صرف ظرفيت­سنجي و هماهنگي تحقيقات براي انجام اين پروژه بزرگ و بين­المللي گرديد. اين پروژه در آغاز به عنوان يك برنامة 15 ساله مطرح گشت اما پيشرفت­هاي قابل ملاحظه­اي كه در اجراي آن حاصل آمد، عملاً زمان اجراي آنرا كاهش داد به طوري­كه محققان پروژه اميدوارند نتايج آن تا پايان سال 2003 منتشر گردد.

اهداف و زمانبندي پروژه:

اين پروژه با اهداف زير به اجرا درآمده است:

 1-شناسايي تقريباً همة ژن­هاي موجود در ژنوم انسان( بيش از 100 هزار ژن)

2-تشخيص توالي 3 ميليارد باز آلي كه ژنوم انسان را شكل داده­اند

3-ذخيره­سازي اطلاعات در پايگاه­هاي اطلاعاتي

4-ارتقاي روش­ها براي تحليل اطلاعات

5-انتقال فناوري به بخش­هاي خصوصي

6-نمايان ساختن جنبه­هاي اخلاقي، قانوني و اجتماعي كه انتظار مي­رود از اين پروژه حاصل شود 

اهداف نهايي برنامه سوم در طي برگزاري كارگاه­هاي متعدد پايه­ريزي شد. اين كارگاه­ها توسط دپارتمان انرژي و موسسه ملي بهداشت آمريكا و با همكاري 18 كشور دنيا و كمك قابل توجه مركز سانجر در انگلستان و مراكز تحقيقاتي آلمان، فرانسه و ژاپن به اجرا درآمد

 چگونگی انجام پروژه ژنوم انسان

در انجام پروژه ژنوم انسان (HGP) برای شناسایی ژنها از روشهای مختلف نقشه برداری ژنوم استفاده شده است و به مرور زمان تکنیکهای پیشرفته تری برای انجام پروژه ، بکار گرفته می شود. روال کار برای تعیین توالی ژنوم انسان به این صورت بود که ابتدا کل ژنوم انسان بصورت کتابخانة BAC تهیه شده و سپس با روشهای مختلفی از این کلونها ، کانتیگ تهیه می شد. سپس قطعات وارد شده در هر یک از کلونهای کانتیگ تعیین توالی می شد. در سال 1992 کار تهیه کانتیگ برای کل کروموزوم21و Y به اتمام رسید . برای تهیه کانتیگها بطور همزمان نقشه برداری ژنتیکی نیز استفاده می شد. در سال 1994 نقشه ژنتیکی ژنوم انسان با حد تفکیک cM1 با استفاده از مارکرهای پلی مورف تهیه شد.سرانجام در فوریه سال 2001 ، HPG اعلام کرد که تعیین توالی 90% یوکروماتین ژنوم انسان به اتمام رسیده است . البته در همان تاریخ شرکت Celera نیز اعلام کرد که 93% یوکروماتین ژنوم انسان را به روشی دیگر تعیین کرده است . شرکت Celera در سال 1998 ادعا کرده بود که می تواند ژنوم انسان را ظرف سه سال با روش دیگری تعیین توالی کند.در این روش بجای اینکه ابتدال کلونهای موجود در کتابخانه ژنوم را بصورت کانتیگ مرتب کرده و سپس تعیین توالی کنند، ابتدا BAC ها را تعیین توالی کرده و سپس از یک الگوریتم کامپیوتری برای تعیین ترتیب قطعات کلون شده استفاده می شود. با تکمیل پروژه ژنوم انسان ، شناسایی ژنها ، شناسایی جهشهای بیماریزا، تشخیص بیماریهای ژنتیکی ، تشخیصهای قبل از بروز علائم ، پیشگیری از بروز بیماری های ژنتیکی و … بسیار آسان خواهد شد . بطور کلی پروژه ژنوم انسان نه تنها چهره علم ژنتیک مولکولی انسانی را دگر گون ساخت بلکه بر اکثر علوم زیستی تاثیر زیادی گذاشته است.ژنوم اورگانیسمهای مدل:یکی از اهداف پروژه ژنوم ، تعیین توالی ژنوم و شناسایی ژنهای اورگانیسمهای مدل است.اورگانیسمهای مدل در انجام بسیاری از تحقیقات ژنتیکی بکار میروند .با مشخص بودن ژنوم این جانداران انجام این تحقیقات با دقت و سهولت بیشتری انجام خواهد شد.در برنامه پروژه ژنوم ، تعین توالی ژنوم و شناسایی ژنهای برخی از جانداران مانند E.coli بعنوان نماینده پروکاریوتها و ساکاومایسس سرویزیه ، C.elegans وموش بعنوان نمایندگان یوکاریوتها انجام شده است.. بسیاری از ژنهای مخمر با ژنهای انسان اورتولوژی دارد و برای بررسی عملکرد این ژنها اغلب از مخمر از نظر آزمایشگاهی کار با آن ساده تر است استفاده میشود. C.elegans که یک جاندار پر سلولی ساده است برای تحقیق در مورد تنظیم بیان ژنها در تمایز سلولی، فرایند پیری و اپوپتوز بکار میرود .موشها نیز بعنوان پستانداران عالی دربررسی بسیاری از بیماریهای ژنتیکی و سرطانها بکار میروند. با نزدیک شدن به اتمام پروژه ژنوم انسان ، هم اکنون دانشمندان پروژه جدیدی را بنام پروژه پروتئوم انسان ، شروع کرده اند هدف این پروژه شناسایی کلیه پروتئینهایی است که در سلولهای انسان بیان می شوند (پروتئوم ) این پروژه به رهبری سازمان پروتئوم انسان یا HUPO در حال انجام است . با انجام این پروژه خصوصیات کامل پروتئینهای سلولی ، عملکرد آنها و زمان بیان آنها مشخص خواهد شد

 چند نمونه تهيه نقشه ژنتيكي

به منظور حفظ ارقام داخلي پسته ، نقشه ژنتيكي ارقام پسته كشور با استفاده از روش هاي علمي مهندسي ژنتيك در موسسه تحقيقات بيوتكنولوژي در دست تهيه است.

پژوهشگران عربستان سعودی با تنظیم اولین نقشه ژنتییک عربی بر اطلس ژنتیک جهانی تلاش دارند به منظور مشخص کردن نقش ژن در بیماری وبهبود خدمات درمانی از آن استفاده کنند

پس از دو سال کار مداوم برزيليان موفق به تهيه يک بانک اطلاعاتی ژنتيکی از درختان قهوه به منظور افزايش کيفيت  توليد و کاهش هزينه های توليد قهوه شدند. اين بانک اطلاعاتی شامل بيش از ۲۰۰هزار دی ان ای و ۳۵ هزار ژن ميباشد

 اهميت و ضرورت

1.     شناسایی ژنها

2.     شناسایی جهشهای بیماریزا

3.     تشخیص بیماریهای ژنتیکی

4.     پیشگیری از بروز بیماری های ژنتیکی

5.     پيشبيني در مورد عملكرد ژن

  1. تعيين رابطه خويشاوندي (فيلوژنتيكي)

نقشه يابي ژن ها و تهيه نقشه هاي ژنتيکي کاري اساسي در علم ژنتيک محسوب  مي شود، زيرا بخش عمده اي از علم ژنتيک با درک توارث صفات ويژه  و دست ورزي آنها در ارتباط مي باشد.

به طور مثال در گياهان و حيوانات مهم از نظر کشاورزي، اين گونه اطلاعات به منظور به نژادي و شناسايي نسل هاي واجد صفات مطلوب به کار مي رود و يا در مورد انسان هدف تشخيص پيش از تولد بيماريهاي زنتيکي است

پيوستگي ژنتيکي مستلزم آن است که جايگاههاي ژني روي يک کروموزوم از نظر فيزيکي به اندازه کافي به هم نزديک باشند بنابراين براي تعيين محل يک ژن جديد بر روي نقشه ژنتيک ، نياز به وجود تعداد زيادي نشانگر مختلف در طول هر کروموزوم است که در بهترين حالت بايد در فواصل يکنواخت نسبت به يکديگر قرار گرفته باشند

پيشرفت هاي حاصله در فناوري DNAنوترکيب و از جمله کاربرد کاوشگرهاي DNA براي تشخيص چند شکلي در تواليهاي DNA منجر به شناسايي تعداد زيادي مکان ژني نشانگر شده است

در ابتدا نقشه هاي ژنتيکي به منظور فراهم کردن منابعي براي تجزيه و تحليل ژنتيکي درگونه هاي خاص ايجاد شدند، اما اخيراً با استفاده از اين نقشه ها مشخص شده که نه تنها در بين گونه هاي نزديک به هم بلکه حتي بين گونه هاي دور از هم نيز ترتيب ژنها تا حد زيادي حفظ شده است. در ژنوم موجودات مختلف يعني ژنوم هاي باکتريايي، ويروسي و اندامک هاي درون سلولي از يک طرف و ژنوم هاي هسته اي يوکاريوتها از طرف ديگر اختلافات زيادي وجود دارد. در يوکاريوتها نيز اختلافات زيادي در نوع توالي ها، مقدار DNAو تعداد کروموزومها ديده مي شود. معناي اين تنوع گسترده آن است که روش هاي توالي يابي و نقشه يابي به ژنوم مورد مطالعه بستگي دارد


ن : ولی اله مهدیزاده
ت : دوشنبه 19 دی1390

 قارچهای میکوریز از با اهمیت ترین میکروارگانیسمهای موجود در اغلب خاکهای تخریب نشده می باشند. بر طبق تخمین های موجود حدود 70 درصد از توده زنده جامعه میکروبی خاکها را میسلیوم این قارچها تشکیل می دهد (Mukerji and Chamola, 2003). اولین گزارش مبنی بر وجود این قارچها در اطراف ریشه گیاه میزبان و بوجود آمدن یک رابطه همزیستی به تحقیقات صورت گرفته توسط هارتیگ (Hartig) در سال 1840 مربوط میشود. وی اگرچه این قارچها را بعنوان یک ارگانیسم مستقل معرفی نکرده است لیکن وجود ریشه های ظریف ویژه ای را در اطراف سیستم ریشه ای درخت کاج گزارش کرده است. ریسک (Reissek) در سال 1847 این قارچها را بعنوان موجودی مستقل در همزیستی با گیاهان ارکیده شناسایی و معرفی کرد. کامینسکی (Kamienski) در سال 1881 عنوان نمود که اطراف سیستم ریشه ای برخی از درختان با لایه ای از قارچ پوشیده شده است و عناصر غذایی موجود در خاک با عبور از این لایه بوسیله سیستم ریشه ای گیاه جذب می شوند. در سال 1885 پروفسور فرانک  (Frank) که بدنبال بررسی راهکارهایی به منظور کشت قارچهای خوراکی در منطقه جنگلی Prussia بود ساختمان حاصل از فعالیت مشترک ریشه گیاه میزبان و قارچهای میکوریز همزیست را شناسایی نمود (Paul and Clark, 1989).

اصطلاح میکوریز در واقع از دو بخش یکی کلمه یونانی Mikes به معنای قارچ و دیگری کلمه Rhiza با ریشه ای لاتین به معنای ریشه تشکیل شده است. از زمان شناسایی این رابطه همزیستی تاکنون دانشمندان این رابطه را از ابعاد مختلف تعریف کرده و اهمیت آن را یادآور شده اند.

همزیستی میکوریزایی بین اغلب گیاهان آوندی (بیش از 85 درصد) با قارچهای میکوریز موجود در خاک و متعلق به سه رده Ascomycetes، Basidiomycetes و Zygomycetes بوجود می آید و نتیجه حاصل از این همزیستی فعالیت قارچ در جهت جذب و انتقال عناصر غذایی به گیاه میزبان از یک طرف و از طرف دیگر دریافت ترکیبات کربنه حاصل از فتوسنتز گیاه میزبان توسط قارچ همزیست می باشد
(Harlyand smith, 1983).


سلام
اطلاعات خیلی خوبی بود.

ممنون می شم منابعی که استفاده کردینو به طور کامل در صورت امکان برام میل کنید






:: موضوعات مرتبط: قارچ شناسی، بیماری شناسی
:: برچسب‌ها: تعریف و اهمیت رابطه همزیستی میکوریزایی
ن : ولی اله مهدیزاده
ت : دوشنبه 19 دی1390

مقدمه

قبل ازپيدايش ماركرهاي مولكولي اساس انتخاب اصلاحگران روي ويژگيهاي فنوتيپي بود.با توسعه تكنولوژي نشانگرها اصلاحگران ابزارقابل رديابي كل ژنوم در غياب نشانه هاي فنوتيپي طراحي كردند(Henry, 2001).

صفات متفاوت بين افراد ناشي از تفاوتهاي موجود بين رديف DNA کروموزوم هاي آنهاست که به نتاج نيز منتقل مي شود. حتي صفاتي که تحت تاثير شرايط محيط نيز به صورت متفاوت بروز مي کنند، بازتاب تفاوتهاي موجود در رديفهاي DNA هستند. اين تفاوتها مي توانند به عنوان نشانه يا نشانگر ژنتيک (Genetic Marker) به کار گرفته شوند .

به عبارت ديگر کلمه نشانگر(Marker) مترادف با جایگاه نشانگر است. يک جایگاه نشانگر جایگاهای چند شكلي است که :

 1) ژنوتيپ افرادي که آن را حمل مي کند تعيين مي کند. به اين منظور از نشانگرها در ژنتيک جمعيت استفاده مي شوند.

 2) ژنوتيپ يک يا چند جای متصل به نشانگر را تعيين مي کند که کاربردهايي از همسانه سازي تا انتخاب نشانگر دارد.

مطابق اصطلاح نشانگر بيشترین استفاده نشانگرهاي ژنتيکي در:

1- نشانگرهاي مرفولوژيکي (Morphological Markers)

2- نشانگرهاي مولکولي در سطح DNA (Molecular Markers)

3- نشانگرهاي بيوشيميايي مثل پروتئين ها و آيزوزايم ها (Biochemical Markers) می باشد.

(Vienne  et al., 2003).

خصوصیات نشانگرهای ژنتيکي مناسب

نشانگرهاي ايده ال عبارت است از:

- Polymorphic:

- Multiallelic

-  Codominant: يک هيبريد هتروزيگوس به طور همزمان خصوصيات والدين هموزيگوس را دارد و در يک نسل، هتروزيگوس ها مي تواند از هرکدام از هموزيگوس ها متمايز شوند.

-  Non- epistatic: ژنوتيپ از فنوتيپ برداشت مي شود، هر نوع ژنوتيپ از لوکوس ديگري مي تواند باشد. همبارزيت و غيرهم پوشاني به ترتيب در غياب تعامل جایگاه هاي Intra, inter مشخص مي شوند.

-  Neutral: جانشيني آللي در جایگاه نشانگر که تاثيرات فنوتيپي يا انتخابي ندارد. همچنين تمام چند شکلي هاي مولکولي Neutral (نامعين) هستند.

-  Insensitive: ژنوتيپ از فنوتيپ برداشت مي شود و يا از جسمي که در محيط است  (Vienne  et al., 2003).

نشانگرهاي مرفولوژيکي با اين معيارها معرفي نمي شوند.آنها شامل دامنه وسيعي از ژنهاي كنترل  كننده صفات فنوتيپي هستند. اين نشانگرها معايب زيادي دارند.از جمله اينكه آنها پلي مورفيسيم ناقص و عموما غالب (Dominant) هستند. اغلب جلوي ساير ويژگي ها و خصوصيات را مي گيرند و توسط محيط تحت تاثير قرار مي گيرند. نشانگرهاي مورفولوژيکي در گونه هاي بخصوصي فراوان هستند. تعداد کمي از آنها مي توانند پيوسته چندشکلي در يک نسل بدهند.گاهي براي مشاهده وثبت آنها بايد منتظر ظهور آنها ماند.

بيشتر نشانگرهاي مولکولي يا بيوشيميايي خصوصیات مذکورراداراهستند.معمول ترين نوع نشانگرهاي پروتئيني آيزوزايم ها هستند كه فرم هاي مختلف يك آنزيم را نشان مي دهند. نشانگرهاي پروتئيني تغييرات را در سطح رديف و عمل ژن به صورت نشانگرهاي همبارز نشان مي دهند. از معايب اين نشانگرها محدوديت تنوع ژنتيك قابل ثبت در آيزوزايم ها ست. به عبارت ديگر آيزوزايم هانه تنها كم هستند، بلكه چند شكلي وتفاوت قابل ثبت نيز درآنها چندان زياد نيست. محدوديت اصلي آيرزوزايم ها کم بودن تعداد جایگاه است که مي توانند توسط آنها رديابي شوند.تعداد آيزوزايم هاي قابل ثبت ومشاهده كه ميتوان از آنها به عنوان نشانگر استفاده كرد به يكصد عدد نمي رسد . اين محدوديت در تعداد نشانگرهاي آيزوزايم از عمده ترين معايب آنهاست وموجب كاهش كارايي آنها مي شود. همچنين همه آنزيم ها در همه موجودات فعال نيستند يا وجود ندارند.

در مقايسه مارکرهاي در سطح DNA تقريبا تعداد بي شماري هستند و غيروابسته به مرحله اي يا ارگاني که تجزيه شده است، تا زماني که DNA در همه بافتها يکسان وجوددارد (Vienne  et al., 2003) DNA ماده ژنتيکي همه سلول ها است و همه جنبه هاي وجودي سلول را کنترل مي کند. شناسايي و درک کامل بسياري از پديده هاي زيست شناختي متکي به ايجاد و توسعه روشهاي توالي يابي DNA بوده است و تاکنون از اطلاعات از اين توالي ها در زمينه هاي مختلف مانند، پزشکي، باستانشناسي، کشاورزي و غيره استفاده شده است((Philips and Vasil, 20001.نشانگرهاي مولكولي تازماني كه تنوع در تواليDNA بين افراد وجود دارد پلي مورفيك هستند. بنابراين اين نشانگرها به عنوان شاخص تفاوت رديف عمل مي كند(Henry, 2001).

تنوع در توالي هاي DNA موجودات زنده به صورتهاي متفاوتي ظاهر مي شود. اين تفاوتها مي تواند روي فتوتيپ موجود اثر بگذارد و در صفات مورفولوژيکي تجلي يابد، که با نشانگرهاي فنوتيپي قابل شناسايي مي باشد. نشانگرهاي ژنتيکي نيز با تجزيه و تحليل DNA محققين علم ژنتيک را در زمينه هاي مختلف نظير؛ مطالعات فيلوژنتيک، تعيين ميزان قرابت، تهيه نقشه هاي ژنتيکي، تعيين محل ژنهاي کنترل کننده صفات کمي و کيفي، انتقال ژن، تشخيص بيماري ها و غيره ياري مي رساند. تا كنون تعداد زيادي از نشانگرهاي  DNAمعرفي شده اند ودر تجزيه هاي ژنتيك موجودات مورد استفاده قرار گرفته اند.اين نشانگرها از نظر ويژگيهاي يادشده با همديگر متفاوت اند.انتخاب بهترين نشانگر به هدف مطالعه(انگشت نگاري، تهيه نقشه پيوستگي، ژنتيك جمعيت وروابط تكاملي ) وسطح پلوئيدي موجود مورد مطالعه بستگي دارد.به دليل اهميت ونقش موثرPCR،نشانگرهاي ژنتيکي به دو دسته كلي نشانگر هاي DNAمبتني بر كاربرد واکنش زنجيره اي پليمراز و نشانگرهاي DNA غير مبتني كاربرد بر واکنش زنجيرهاي پليمراز تقسيم مي شوند. نشانگر هاي  DNAگروه بزرگي از نشانگرها را تشكيل مي دهند اين نشانگرها سير تحول و تکامل خود را به پايان نرسانيده اند و ابداع و معرفي روشهاي متنوع و جديدتر ثبت و مشاهده ژنتيکي بين موجودات از طريق مطالعه مستقيم تفاوتهاي موجود در بين رديف DNA آنها همچنان ادامه دارد(Philips and Vasil, 2001).                                        



:: برچسب‌ها: ماركرهاي مولكولي
ن : ولی اله مهدیزاده
ت : دوشنبه 19 دی1390

جنس فوزاريوم شامل قارچهاي هيفوميست خاکزي است که اهميت اقتصادي زيادي دارد و شامل بسياري از گونه هاي بيماريزاي گياهي مي باشد که دامنه وسيعي از گياهان ميزبان مانند گوجه فرنگي، سيب زميني، بقولات و خانواده گندميان از جمله گندم، جو، يولاف ، ذرت و نيشکر، ميخک، بسياري از سبزيجات وساير گياهان را آلوده ميکند (Nelson et al., 1983; Burgess et al., 1994).اين قارچ انتشار وسيعي در تمام نواحي جهان داشته و بسياري از گونه هاي آن به صورت کلاميدوسپور در خاک، بافت و يابه صورت ميسيليوم فعال و غير فعال در بقاياي میزبان و مواد آلي بسر مي برند (Burgess et al., 1994). گونه هاي مختلف فوزاريوم علاوه بر بيماريزايي روي گياهان و محصولات عمده سبب آلودگي هاي ميکوتوکسيکوز (mycotoxicoses) و مايکوتيک(mycotic) در انسان و ديگر حيوانات مي شوند (Nelson et al., 1993). برخي از گونه هاي فوزاريوم مانند  ( Fusarium verticilioides  (syn=F.  moniliform سبب بلايت گياهچه، پوسيدگي ريشه و ساقه ذرت و کاهش محصول ذرت بطور ميانگين 8-4 درصد در سال شد ه ، علاوه بر ذرت موجب بيماري در موز،انجير، کاج، برنج و سورگوم مي شود (Nelson    et  al.,  1993). همچنين در آزمايشات مختلف نشان داده شده است که توکسين هاي ناشي ازاين قارچها سبب سرطان زايي در حيوانا تي مانند ميمونها ، جوجه ها ، جوجه اردک ها،  موش وخرگوش مي شود (Nelson et al., 1993).بعلاوه برخي فوزاريومها بويژه  آنهایی که در بخش ليزيولا (Section Liseola) قرار دارند، توليد طیف وسيعي از توکسين ها شامل تريکوتسين ها (tricothecenes)، فومونيزين ها (fumonisins ) و فوزاريک اسيد کرده که موجب سرطان زايي و بزرگ شدن کبد مي شود و برخي ديگر توليد متابوليت هاي ثانويه مانند جيبرلین کرده که به عنوان هورمون رشد عمل میکند(O,Donnell1996). 

 

 



:: موضوعات مرتبط: قارچ شناسی
:: برچسب‌ها: فوزاریوم
ن : ولی اله مهدیزاده
ت : دوشنبه 19 دی1390

 هدف استخراج كل پروتئين و تعيين مقداركمّي و بعد مقايسة كيفي مي باشد .

بايد بتوانيم total protein  را استخراج كنيم تا آن را با شاهد مقايسه كنيم و ميزان آن را اندازه بگيريم .

براي مقايسه تيمار يك هورمون و واكسن يا هر عامل ديگر روي ميزان پروتئين ، ميزان مشخص پروتئين از گياه تراريخت استخراج كرده ، هم كل آن را اندازه مي گيريم و هم كيفيت آن را تا بفهميم كداميك افزايش يافته و كدام كاهش يافته اند .

براي مثال 1 گرم برگ را از نمونة تازه (اگر شرايط استخراج از نمونه تازه وجود نداشته باشد از نمونه هايي كه پس از وزن شدن ، ليبل شده و در ازت مايع قرار داده شده اند استفاده مي شود )را برمي داريم .وزن اوليه بايد دقيقاً مشخص باشد تا بتوانيم تخمين بزنيم كه كل پروتئين در مقدار مشخص گياه چه ميزان بوده است .اين 1 گرم را در هاون و به كمك ازت مايع مي كوبيم تا پودر شود و بعد طبق پروتكل بافر به آن اضافه مي كنيم . سانتريفوژ و مراحل بعدي نيز به ترتيب انجام مي شوند كه  شرح آنها  داده خواهد شد .

اين اعمال را مي توان در چندين مرحله انجام داد تا كلروفيل ، كاروتنوئيدها و... را نيز اندازه گرفت .

بعد از استخراج ، به دو بخش تقسيم مي كنيم

1.     براي اندازه گيري با اسپكترو فتومتري كه اين نمونه هرچه تازه تر باشد بهتر است .

2.     بخشي كه به همراه بافر جوشانده مي شود و الكتروفورز ميگردد و به راحتي مي توان در فريزر نگهداري نمود .

هنگامي كه ژني را منتقل مي كنيم و يا تيماري را روي گياه تست مي كنيم ، بايد تأثير آن را روي پروتئينهاي كل گياه بررسي كنيم .

مطابق پروتكل برادفورد ، µl10 پروتئين استخراج شده را با  µl990 از بافر برادفورد مخلوط و چند دقيقه صبر مي كنيم تا واكنش انجام شود.براي وجود استاندارد ، پروتئينهاي استاندارد با غلظت و وزن معين تهيه مي كنيم (دقيقاً مشابه نمونه هاي اصلي µl10 پروتئين نمونه اصلي را با µl990 از بافر برادفورد مخلوط مي كنيم ).حتي بطور چشمي هم ميتوان اختلاف غلظتها را مشاهده نمود . از صفر تا 100 به تدريج  رنگ از آبي روشن به تيره مي گرايد.

سپس از پائين ترين غلظت  كه صفر است در دستگاه اسپكتروفتومتر مي گذاريم و دستگاه را صفر مي كنيم و بعد با گذاشتن ديگر غلظتها و اعداد حاصل از آنها خط رگرسيون مربوطه را رسم مي كنيم .

سپس نمونه ها را در دستگاه قرار مي دهيم و اعدادي كه به ما مي دهد را در فرمول قرار مي دهيم كه به اين ترتيب غلظت را به ما مي دهد. با اين روش به راحتي نمونه هايي را كه ناشناخته اند و غلظت آنها را نمي دانيم ، مشخص مي كنيم .

بعد از محاسبات كمّي ، نوبت به مقايسات كيفي مي رسد .

گاهي در گياه تراريخت و شاهد ، ميزان پروتئين كل ، يكسان است . در اين حالت نمي توان نتيجه گرفت كه تفاوت آنها معني دار نبوده ، زيرا ممكن است با وجود يكساني برآيند ،  روي ژل پلي اكريل آميد تفكيك شوند .

براي مثال در ميزان پروتئين KD 75، در گياه تراريخت ، 5 برابر افزايش و در پروتئين ديگر در شاهد كاهش ديده مي شود . پس به كمك الكتروفورز ، معجون پروتئيني تفكيك و باندها مقايسه مي شوند .

گاهي باندي بر روي SDS-PAGE ديده نمي شود (با وجود اينكه باند ديده نمي شود ، با شاهد تفاوت دارد ) در اين حالت نمي توان كيفيت را مشخص نمود و بايد به روش ديگري مانند enzyme assay همان پروتئين را شناسايي كنيم . با اين روش حتي اگر توليد  پروتئين در گياه تراريخت در حد ppm 100باشد نيز قابل تشخيص است .

روش ديگري براي بررسي تفاوت در تراريخت و شاهد ، استفاده از آنتي ژن خاص در سلولهاي سرطاني است . در سلول نرمال براي مثال باند KD 50-47 ديده مي شود . چنانچه علاقمند به استخراج اين باند براي توليد آنتي بادي باشيم ، براي مثال به دنبال ژن مقاومت به سياهك در ارقام حساس و مقاوم (ايزولاين ) بوده ايم و باند اضافي كه در رقم مقاوم ديديم را احتمالاً با مقاومت مرتبط مي دانيم (يا يك گياه را با اسپور قارچ تيمار كرده ايم كه پروتئين را بيان مي كند و گياه ديگر را تيمار نكرده ايم كه پروتئيني توليد نمي كند ). اكنون بايد ژن را شناسايي كنيم .مي توان از طريق HPLC همان پروتئين را استخراج و تخليص نمود و نيز مي توان آنتي ژن خاص براي توليد آنتي بادي پلي كلونال يا منوكلونال باشد تا آنتي بادي توليد و سپس از طريق آنتي بادي ، ژن را شناسايي كنيم .

·   از طريق HPLC و به كمك پيك هايي كه به ما مي دهد ، وقتي پروتئين مورد نظر از ستون خارج مي شود آن را جمع آوري و سپس تخليص مي كنند و به موش يا خرگوش تزريق مي كنند و به اين ترتيب آنتي بادي توليد مي گردد.پس از آن با ساخت cDNA و به كمك expresstion vector ، كتابخانه بياني توليد مي گرددو با آنتي بادي، از ميان هزاران كلوني دقيقاً كلوني مورد نظر را بيرون مي كشد.

 

نحوة استخراج پروتئين:

بر اساس پروتكل داي و همكاران انجام مي شود .

1-   1 گرم برگ را از نمونة تازه (اگر شرايط استخراج از نمونه تازه وجود نداشته باشد از نمونه هايي كه پس از وزن شدن ، ليبل شده و در ازت مايع قرار داده شده اند استفاده مي شود )را برمي داريم .وزن اوليه بايد دقيقاً مشخص باشد. اين 1 گرم را در هاون( كه براي جلوگيري از تجزيه پروتئين با ازت مايع خنك شده است ) و به كمك ازت مايع مي كوبيم تا پودر شود (اين كار در گندم بدليل ديواره سيليسي آن مشكل تر از توتون است )

2-   بعد طبق پروتكل به ازاي هر گرم برگ ml3  بافراستخراج ( مخلوطي از Tris HCl  ، مركاپتواتانول وNa-EDTA )  به آن اضافه مي كنيم .اگر دز پروتئين در نهايت پائين بيايد ، بدليل ظرفيت كمِ چاهك ، ميزان بافر را كم مي كنيم تا غلظت پروتئين بالا رود يعني به جاي ml3 بافرml2 اضافه مي كنيم .هنگامي كه بافر را در همان هاون اضافه كرديم ، آنقدر به كوبيدن ادامه ميدهيم تا حباب خارج شود كه نشانة استخراج پروتئين است . هنگامي كه هموژنايز شد روي يخ و در يخچال نگه داري مي كنيم تا تجزيه نشود.

3-      سانتريفوژ در rpm11500 و براي 21 دقيقه صورت مي گيرد .

4-   سپس سوپر ناتانت را برميداريم و دوباره 20 دقيقه در rpm 4000  مي گذاريم (اگر به سانتريفوژ 11500 دور، دسترسي نباشد ، مدت زمان را بيشتر مي كنيم يعني در مرحله اول ، rpm5000  براي 30 دقيقه).

 الكتروفورز :

به روش لاملي و همكاران صورت مي گيرد .

ژل در اين حالت از نوع پلي اكريلاميد و بصورت عمودي تهيه مي شود . پلي اكريلاميد بسيار خطرناك است و هنگام كار با آن بايد دستكش لاتكس و ماسك داشته باشيم .

ژل بصورت ناپيوسته و داراي دو بخش مي باشد .

1.     ژل فوقاني(متراكم كننده ) كه 4% تهيه مي شود و پروتئينها را در مرز دو ژل متراكم مي كند .

2.     ژل تحتاني (جدا كننده ) كه باغلظتهاي مختلف 15-7% مي باشد وباعث فاصله گرفتن پروتئينها مي شود .

هرچه درصد ژل بالاتر باشد پروتئينهاي با وزن ملكولي پائين تري را تفكيك مي كند .

ژل 7% پروتئينهاي با وزن ملكولي بالا (KD 500-50 )

     ژل 10% كه بيشتر استفاده مي شود (KD 300-20 )

     ژل 12% پروتئينهاي با وزن ملكولي (KD 200-10 )

     ژل 15% پروتئينهاي با وزن ملكولي پائين (KD 100-3 )

 نكته:

·   هرچه درصد ژل پائين تر باشد ، شكننده تر است . براي مثال ژل 7% كشسان مي شود و كار با آن مشكل است .در صورتيكه ژل 15-10% راحت تر مي باشد

·   با استفاده از يخ در cooling system ، ژل سفت تر مي شود و باندهاي شارپ تري نيز حاصل مي گردد . اگر از يخ استفاده نشود بدليل استفاده از ولتاژ بالا حرارت زياد شده و ژل ، شل شده و به شيشه مي چسبد و جدا كردن آن مشكل است .

بافر ژل فوقاني Tris HCl  0.5 M   (PH=6.8)  مي باشد .

بافر ژل تحتاني Tris HCl  3 M   (PH=8.8)  مي باشد .

این بافرها حاوی SDS هم هستند که باعث می شود همه پروتئین ها همبار و دارای بار منفی شوند و جداسازی فقط بر اساس وزن مولکولی صورت گیرد.

براي تنظيم PH تريس از  12N HCl استفاده مي كنيم .

·   تنظيم PH در  بافرها بسيار مهم  مي باشد.اگر به اندازة مقادير گفته شده نباشد ، حركت در ژل كند و زمان بر مي باشد و باندها بصورت لبخندي در مي آيند .در تهيه محلولها براي تنظيم PH بافر ژل تراكم ، ابتدا در مقدار كمتري آب حل مي كنيم تا بتوان با HCl  تنظيمات را انجام داد .

مراحل کار بدین صورت است:

1- براي آماده سازي قالب ژل، در ميان دو شيشة آن spacer  ( كه قطرهاي مختلف دارد ، قرار مي دهيم ) . قاب داراي حجم مشخص است كه بر اساس آن مواد را تهيه مي كنيم . سپس قبل از ريختن مواد بايد قاب را با آگارز 1% درز بندي كنيم و با آب مقطر تست مي كنيم تا نشت نداشته باشد .

2- حال برای تهیه ژل تحتانی به ترتیب به  صورت زیر عمل می کنیم :

1- بافر ژل

7.5 میلی لیتر

2- اکریل آمید (30 گرم اکریل آمید را با 0.8 گرم بیس اکریل آمید مخلوط  و حجم آن را به 100 میلی لیتر رسانده و در تاریکی نگهداری)

12.5 میلی لیتر

3- آب مقطر

10.25 میلی لیتر

4- APS(10%)

0.125 میلی لیتر

5- تمد (10%)

0.125 میلی لیتر

    بعد از اضافه کردن این مواد اینها را خوب بهم زده و بعد به آرامی 3/2 طول قالب را با این ژل پر کرده و سپس روی آن مقداری آب مقطر اضافه کرده  چون پلیمریزاسیون ژل در شرایط عدم وجود اکسیژن انجام می گیرد . بعد از چند دقیقه  زمانیکه خط شکست آب و ژل ریخته شده صاف شد نشان دهنده این است که ژل بسته است.

بعد آب را خالی کرده و با بافر ژل بالایی شستشو می دهیم ومحتویات ژل بالایی را که به صورت زیر درست شده اضافه می کنیم.

3- تهیه ژل بالایی بدین صورت است:

1- بافر ژل

2.5 میلی لیتر

2- اکریل آمید ( مانند ژل پائینی درست می شود)

1.3 میلی لیتر

3- آب مقطر

6.1 میلی لیتر

4- APS(10%)

0.1 میلی لیتر

5- تمد (10%)

0.1 میلی لیتر

 4- بافر نمونه شامل گليسرول ، SDS ،2 مركاپتواتانول و برومو فنول بلو( برای مشاهده حرکت نمونه ) كه به همراه  نمونه به نسبت مساوي با هم مخلوط و به مدت 5 دقیقه جوشانده مي شود .

5- بعد قبل از انجام الكتروفورز ، spacer را خارج و آگارز را پاك مي كنيم  تا ته ژل در تماس مستقیم با بافر قرار گیرد.

6- بعد گیره ها را برداشته و سپس قالب را در تانک قرار می دهیم و حباب های تشکیل شده را با سرنگ می گیریم تا اختلالی در جریان اتفاق نیافتد.

7- بافر تانك را بطوري مي ريزيم كه سطح ژل را از بالا بگیرد و بافر را در پائین هم می ریزیم (بافر الكتروفورز حاوي  تريس ، گلايسين و SDS مي باشد).

8- سپس نمونه ها را با سرنگ همیلتون برداشته و در هر چاهک می ریزیم.

9- سیستم خنک کننده را روشن کرده( تا ژل شل نشده و باندها کج نشوند).

10- ولتاژ را به میزان 100 تا 120 ولت برقرار کرده که در این حالت جریان 30 میلی آمپر است.

 نكات:

·   نقش SDS : براي جلوگيري از افزايش حجم ، به همه پروتئينها بار منفي داده و آنها را بصورت خطي در مي آورد .

·   APS بايد بصورت تازه تهيه شود و حداكثر تا 3 روز مي توان نگهداري نمود . اما اكريلاميد را تا شش ماه مي توان نگهداري نمود

·   پرسولفات آمونيوم( شروع كنندة پليمريزاسيون ) و تمد ( عمل كاتاليزوري دارد) بايد در مرحله آخر و قبل از ريختن ژل در قالب اضافه شوند .

·        بهترين دما براي بستن ژل ، 30-20 درجه سانتيگراد مي باشد .

·        روي سطح ژل آب مقطر مي ريزيم تا اكسيد نشود.

·        بهتر است ژل را قبل از load كردن نمونه ها 5/0 ساعت به ولتاژ پائين متصل كنيم

 11- رنگ آميزي ژل:

با رنگ كوماسي بلو انجام مي گيرد . مواد لازم عبارتند از :

5/0 گرم كوماسي بلو (G250)

ml50 اسيد استيك (10%)

ml200 متانول(40%)

که ژل را دراین محلول به مدت 2 ساعت تا یک شبانه روز قرارداده می شود.

12-           مرحله رنگ بری :

به مدت یک شبانه روز در این محلول که حاوی اسید استیک و متانول و آب است ژل را قرار داده و بعد از این مرحله می توان باندهای پروتئینی را مشاهده و مورد بررسی قرار داد.



:: برچسب‌ها: استخراج پروتئين
ن : ولی اله مهدیزاده
ت : شنبه 17 دی1390

روشهاي تعيين توالي

1-ماكسام و گيلبرت

2-سانگر

3-پيروسكونسينگ

4-روش اتوماتيك(كامپيوتري)

5-DNA chip technology

 1-ماكسام و گيلبرت

 1)    نشاندار كردن اتهاي َ5

2)    برش با RE

3)    جداسازي دو رشته

4)    اجاد شكاف با مواد شيميايي

5)    الكتروفورز

مزاياي روش تخريب شيميايي نسبت به روش ختم زنجيره يا ماكسام وگيلبرت

 1-توالي يك قطعه از  DNA كه هيچگونه اطلاعاتي ازان نداريم ، تنها بر اساس نقشه برشهاي ان قابل دستيابي است.

2-تواليهاي بسيار نزديك به ناحيه نشاندار شده قابل تعين هستند.

3-توالي از مولكول اصلي حاصل مي شود.

 2-سانگر

1)    تك رشته كردن   DNA

2)    وارد كردن رشته مورد نظر به حامل تك رشته اي

3)    ايجاد پرايمر نشاندار شده بعلاوه شرايط ومواد موجود براي PCR به همراه ddNTP

4)    الكتروفورز

در اين روش قطعات ر ا با استفاده عوامل موردنيازكه درPCRمورد نيازاست به همراه ddNTPازهر  چهار باز در چهار لوله ازمايش انجام ميشود كه در هنگام انجام PCR نوكلوتيدهاي ddNTP درواكنش قرار گرفته و واكنش را ومتوقف ميكند بعد از الكتروفورز قطعات بر اساس اندازه جدا مي شوند كاز پايين به بالاما توالي را بدست مي اوريم 

 3-پيروسكونسينگ

 در سال 1376 توسط دكتر مصطفي رونقي در مركز ژنوم اسنفورد امريكا ابداع شد

اين روش نيازي به الكتروفورز ندارد و واكنش تعيين توالي به صورت همزمان نمايانده ميشود

1)    DNA-Polymeras از باكتري E.coli

2)    Sulfurylase از مخمر

3)    Luciferasاز كرم شب تاب

4)    Apyrus آنزيمي از سيب زميني

 4) توالی یابی به روش خودکار

اساس کار مشابه روش سانگر

استفاده از 4 نوع پرایمر متصل به چهار گروه فلورسنت مختلف

4 لوله واکنش PCR هر یک شامل :

    DNA الگو + یک نوع پرایمر فلورسنت + DNA Pol + 4 نوع dNTPs + یک      نوعddNTP     

اختلاط محتویات 4 لوله واکنش و الکتروفورز در یک ستون

تابش اشعه U.V و تعیین رنگ توسط دستگاه اسپکتروفتومتر

تفسیر رنگ توسط کامپیوتر و تعیین توالی



:: موضوعات مرتبط: ابزار های مولکولی
:: برچسب‌ها: روشهاي تعيين توالي
ن : ولی اله مهدیزاده
ت : جمعه 16 دی1390

 

 

سمینار کلاسی مقاومت به عوامل بیماری زا (مقطع دکتری) : جاسمونیک اسید سیگنالینگ

NINJA connects the co-repressor TOPLESS to Jasmonate signalling

Nature 464, 788-791 (1 April 2010)

کلیک راست و save as target را بزنید داونلود فایل ارائه

ارائه کننده: ولی اله مهدیزاده

استاد: دکتر مظفری

زمان: سه شنبه -۲۰ دی



:: موضوعات مرتبط: بیماری شناسی
:: برچسب‌ها: سمینار کلاسی مقاومت به عوامل بیماری زا, مقطع دکتری, جاسمونیک اسید سیگنالینگ
ن : ولی اله مهدیزاده
ت : پنجشنبه 15 دی1390